Doslovný preklad pojmu "in vitro" znamená "v skle". Explantátová kultúra in vitro teda predstavuje kultiváciu rastlinných explantátov v umelých, riadených a sterilných podmienkach. V týchto podmienkach sú procesy prebiehajúce v rastlinných bunkách a ich častiach významne ovplyvňované, alebo dokonca úplne riadené. Rastlinný explantát môže byť tvorený časťou rastlinnej bunky, celou bunkou, skupinou buniek, pletivom, časťou alebo celým rastlinným orgánom.
Technológie in vitro poskytujú teoreticky neobmedzené možnosti propagácie rastlín. Okrem toho umožňujú aplikovať techniky, ktoré sú v podmienkach in vivo (v prirodzenom prostredí) neštandardné alebo dokonca nemožné. Základom in vitro kultúry je kultivačná nádoba obsahujúca kultivačné médium a rastlinný explantát. Všetko vnútri nádoby je sterilné.
V rámci in vitro kultivácie je možné kontrolovať a riadiť:
- Osvetlenie (intenzita, kvalita, dĺžka expozície)
- Teplotu
- Prísun a množstvo biogénnych prvkov
- Osmotický tlak
- Hladiny hormónov a tým aj hormonálne riadené procesy
Ďalším dôležitým faktorom, ktorý ovplyvňuje sledovaný proces, je typ (pôvod) explantátu.
Laboratórne vybavenie a priestory
Pracovný priestor laboratória štandardne pozostáva z troch miestností:
1. Prípravná miestnosť
Táto miestnosť slúži na prípravu a sterilizáciu kultivačných médií, sterilizáciu nástrojov a ostatných pomôcok. Zároveň funguje ako sklad chemikálií a používaných zariadení.
2. Miestnosť s flow boxom
Malá miestnosť s flow boxom je určená na sterilizáciu, zavádzanie rastlinného materiálu do kultúr in vitro a jeho pasážovanie na čerstvé alebo iné kultivačné médiá. Činnosť v tejto miestnosti je najnáročnejšia z hľadiska sterilitu prostredia a preto je vybavená aj UV žiaričom.
3. Kultivačná miestnosť
Táto miestnosť je plne automatizovaná. 16-hodinovú fotoperiódu riadi časový spínač a teplota je regulovaná na 25° C pomocou klimatizačného zariadenia s digitálne ovládaným termostatom.
Kľúčové technické prístroje a vybavenie
Flow box
Najdôležitejším technickým prístrojom laboratória je flow box, známy aj ako aseptický laminárny box. Pri správnej starostlivosti zabezpečuje sterilné vnútorné prostredie. Vzduch je sterilizovaný filtráciou cez HEPA filter. HEPA filtre s označením H 14 odfiltrujú častice od veľkosti 0,3-0,5 µm s pravdepodobnosťou odlučiteľnosti 99,999 %. Filtre s označením H 13, hoci lacnejšie, odfiltrujú častice s pravdepodobnosťou 99,997 %. Prúdenie vzduchu cez HEPA filter zabezpečuje výkonný ventilátor a je laminárne, čím sa predchádza vzniku spätných prúdov vzduchu a kontaminácii.
Flow box je tiež vybavený UV žiaričom, ktorý sa zapína približne hodinu pred začiatkom práce na sterilizáciu prostredia.
Ďalšie prístroje
- Digitálny pH meter: slúži na presné určenie pH pripravovaného kultivačného média.
- Nastaviteľná pipeta: umožňuje prednastaviť objem pipetovanej látky, čím zrýchľuje prácu.
- Autokláv alebo teplovzdušný sterilizátor: používa sa na sterilizáciu nástrojov a kultivačných médií zahriatím na 120° C. Je vybavený teplomerom, nastaviteľným termostatom a časovým spínačom.
- Chladnička: udržuje v chlade fytohormóny, ktoré by sa v teple rozkladali, a slúži aj na jarovizáciu semien.
- Klimatizačné zariadenie: v kultivačnej miestnosti udržuje ideálnu teplotu 25° C pomocou digitálneho termostatu.
- Osvetlenie: trubicové žiarivky, ktorých chod riadi časový spínač pre nastavenú fotoperiódu 16/8 hodín.
Príprava a sterilizácia materiálu
Kultivačné nádoby, nástroje a pomôcky sa umývajú vo vode s prídavkom saponátu. Po opláchnutí v "štandardnej" vode sa ešte oplachujú v destilovanej vode, aby sa zabránilo vyzrážaniu solí, ktoré by skresľovali zloženie média.
Nádoby a nástroje sa sterilizujú zabalené v alumíniovej fólii v teplovzdušnom sterilizátore pri teplotách 160° C a vyšších. Ako kultivačné nádoby sa používajú:
- Petriho misky
- Erlenmayerove banky
- Sklenené fľaše so širokým hrdlom
- Široké skúmavky
- Sklenené fľaše so zabrúseným uzáverom
- Rôzne plastové nádoby
Dôležité je, aby uzáver nádoby bol aspoň minimálne priepustný pre plyny. Kovové uzávery sa perforujú a otvor sa upchá molitanom, gumené zátky sa upchávajú vatou. Najvhodnejšie sú transparentné plastové uzávery, ktoré nevrhajú nežiadúci tieň na explantát. Materiál nádoby musí byť sterilizovateľný.
Kultivačné médiá
Kultivačné médiá obsahujú všetky látky nevyhnutné pre rast rastlinného explantátu. Kľúčové zložky zahŕňajú:
- Makrobiogénne a mikrobiogénne prvky: esenciálne minerálne živiny.
- Sacharidy: ako zdroj energie, najčastejšie sacharóza (20 g/l), ale aj glukóza; fruktóza je menej vhodná.
- Vitamíny: najmä tiamín (B1), kyselina nikotínová (PP) a pyridoxín (B6); biotin, kyselina pantoténová, kyselina p-aminobenzoová, cholinchlorid, riboflavín a kyselina askorbová (C) sú potrebné vo veľmi nízkych koncentráciách.
- Rastové regulátory: auxíny (napr. 2,4-D, NAA, IAA, IBA) a cytokiníny (napr. KIN, BA, BAP); často sa používa aj kyselina giberelová (GA3).
- Myo-inositol: osmoregulátor, ktorý zabezpečuje optimálny osmotický tlak v médiu (100 mg/l).
- Agar: spevňuje pevné kultivačné médiá (6-8 g/l) a má aj absorpčnú funkciu, viaže nežiadúce metabolické produkty.
V niektorých prípadoch sa môžu pridávať aj prírodné produkty s empiricky overeným pozitívnym vplyvom.
Delenie kultivačných médií podľa konzistencie:
- Pevné (agarové): s pridaním 6-8 g agaru na liter.
- Polotekuté: so zníženým množstvom agaru.
- Tekuté: bez pridania agaru; vyžadujú neustály pohyb kultúry.
Prakticky každý rastlinný explantát si vyžaduje špecifické zloženie kultivačného média, ktoré sa môže líšiť aj v kvantite fytohormónov. Pri neznámom ideálnom zložení sa používajú osvedčené "univerzálne" médiá, ktoré sa neskôr upravujú na základe pozorovaní.
Príprava kultivačného média
Základom prípravy je presné naváženie jednotlivých zložiek vysokej čistoty. Postup zahŕňa:
- Naváženie makro- a mikroelementov (možno použiť aj zásobné roztoky) a ich rozpustenie v destilovanej vode.
- Úprava pH na požadovanú hodnotu (5,5) pomocou pH metra, KOH a HCl.
- Pridanie a rozpustenie naváženej sacharózy.
- Pridanie agaru a jeho napučanie.
- Doplnenie destilovanej vody do požadovaného objemu.
- Zahrievanie za stáleho miešania až do úplného rozpustenia agaru.
- Pridanie tiamínu, prípadne iných vitamínov a rastových regulátorov v presných koncentráciách.
- Rozliatie média do kultivačných nádob.
Nádoby sa uzatvoria a sterilizujú pri teplote 121° C a tlaku 1,05 kg/cm² v autokláve alebo teplovzdušnom sterilizátore po dobu približne 20 minút. Vyššia teplota a dlhší čas môžu spôsobiť rozklad agaru, denaturáciu vitamínov a fytohormónov. Niektoré citlivé látky sa preto sterilizujú filtráciou cez membránový filter.
Technika prúžkovej platne na izoláciu čistej kultúry_Kompletný postup (mikrobiológia)
Zavádzanie rastliny do kultúry in vitro
Cieľom je premiestniť do kultivačnej nádoby živé a vitálne rastlinné bunky bez prítomnosti patogénov (húb, vírusov, baktérií). To si vyžaduje odobrať explantát z rastlinného organizmu bez patogénov, povrchovo ho vysterilizovať bez poškodenia rastlinných buniek a preniesť ho do kultivačnej nádoby tak, aby sa zabránilo vniknutiu patogénov.
Sterilizácia rastlinného materiálu
Náročnosť sterilizácie závisí od pôvodu explantátu. Sterilizácia listových, stonkových alebo koreňových segmentov či rastových vrcholov je náročnejšia ako sterilizácia rozmnožovacích útvarov s vyvinutou povrchovou ochranou.
Sterilizácia semien
Semená sa sterilizujú zabalené v gáze v 0,2 % roztoku HgCl₂. Alternatívnymi sterilizačnými látkami sú napr. 10-40 % Savo, 5 % chlórové vápno, 2 % chloramin, etanol. Doba sterilizácie sa pohybuje od 5 do 15 minút v závislosti od látky, koncentrácie, štruktúry povrchu a veľkosti semena. Po sterilizácii sa semená 3-krát prepláchnu v destilovanej vode.
Semená menšie ako 0,5 mm sa sterilizujú a oplachujú v injekčnej striekačke, z ktorej sa potom rozptýlia na povrch média.
Práca vo flow boxe
Pred začatím práce vo flow boxe je nevyhnutné umyť a dezinfikovať ruky. Nástroje ako pinzeta sa sterilizujú v liehu a opália nad kahanom. Okraje kultivačných nádob sa tiež sterilizujú plameňom (ak nie sú plastové). Po vychladnutí pinzety sa uchopí semeno (alebo iný explantát) a opatrne sa umiestni na médium bez dotyku stien nádoby.
Po uzavretí nádoby sa označí fixkou a celý postup sa opakuje pre požadovaný počet kultúr.
Detekcia a eliminácia kontaminácie
Rôzne druhy patogénov sa prejavujú odlišne:
- Plesňová kontaminácia: prejavuje sa rýchlym rastom, je dobre identifikovateľná a kultúru zničí v priebehu hodín až dní. Ak ohnisko nie je priamo na explantáte, je možné ho po opätovnej sterilizácii kultivovať v inej nádobe.
- Bakteriálna kontaminácia: signalizovaná ružovým až oranžovým lesklým povlakom na povrchu média. Takáto kultúra je zvyčajne stratená, pretože baktérie sú prítomné aj vnútri explantátu a ich eliminácia pomocou antibiotík je technicky náročná.
- Vírusová kontaminácia: najmenej viditeľná, spôsobuje zmeny v štruktúre explantátu, ktoré môžu byť bežné v in vitro kultúrach a ťažko odlíšiteľné. Vírusy môžu byť prítomné v akejkoľvek časti rastliny okrem meristematického pletiva. Jediným spôsobom ozdravenia rastliny od vírusu je meristémová kultúra. Zavírená rastlina sa v podmienkach in vivo prejaví neprirodzenou farbou, deformáciami, pomalým rastom alebo odumieraním.
Prechod rastlín z podmienok in vitro do in vivo
Rastliny pestované in vitro sú vyživované heterotrofne a po prenesení do prirodzených podmienok sú odkázané na autotrofnú výživu. Táto zmena, spolu so zhoršením a destabilizáciou prostredia a možnou prítomnosťou patogénov, predstavuje výrazný stres, často končiaci odumretím rastliny (regeneranta).
Rastliny in vitro nemajú dobre vyvinutú kutikulu, preto nie sú schopné regulovať výpar. Vyžadujú dlhodobú kultiváciu pri vysokej vzdušnej vlhkosti (blízkej 100 %). Pletivá nie sú prispôsobené na priame slnečné lúče, svetlo musí byť rozptýlené. Substrát by mal byť prirodzene čistý, vhodný je napríklad živý rašelinník.
Moderné rastlinné biotechnológie a ich aplikácie
Moderné rastlinné biotechnológie, vrátane techník in vitro kultivácie, umožňujú cielene upravovať rastliny na mieru. Základom je poznatok o totipotencii rastlinných buniek (schopnosť obnoviť celý organizmus).
Pletivové kultúry
Získavajú sa pestovaním častí pletiva odobratého z materskej rastliny v laboratórnych podmienkach. Po umiestnení na kultivačné médium (obsahujúce minerálne látky, cukor, vitamíny a rastové regulátory) sa poranené bunky začnú deliť a vytvárajú kalus (hojivé pletivo).
Kalusy je potrebné pravidelne (každých 21-28 dní) prenášať na čerstvé kultivačné médium, čím sa zároveň rastlinný materiál rozmnožuje. Roztrepaním kalusov v tekutom médiu možno získať suspenzné kultúry jednotlivých buniek alebo ich zhlukov, ktoré vyžadujú neustály pohyb na trepačkách pre zabezpečenie prevzdušňovania a prístupu k živinám.
Protoplastové kultúry
Bunky zbavené bunkovej steny pomocou enzýmov umožňujú pestovanie protoplastových kultúr. Tieto bunky sa môžu spájať s inými bunkami pomocou polyetylénglykolu alebo elektrického impulzu, čím vznikajú nové bunky schopné vyvinúť sa do kalusu.
Morfogenéza a regenerácia rastlín
Prostredníctvom rastových regulátorov (auxínov a cytokinínov) je možné v kultúre in vitro navodiť tvorbu nových orgánov - proces nazývaný morfogenéza. Cytokiníny podporujú tvorbu výhonkov, zatiaľ čo auxíny podporujú tvorbu koreňov. Výhonky vytvorené na médiu s cytokinínmi sa následne prenášajú na médium s auxínmi na zakorenenie.
Prenos nových rastliniek do pôdy (sadba) si vyžaduje opatrnosť a postupné otužovanie rastlín zmenou vlhkosti prostredia, keďže ich kutikula a prieduchy ešte nie sú plne funkčné. Rastliny postupne prechádzajú na autotrofnú výživu.
Kultivácia organizovaných pletív a orgánov
Okrem neorganizovaných kultúr (odvodených z kalusov) je možné využiť aj už hotové pletivá alebo orgány, napríklad meristém (vrcholová časť rastliny alebo púčiky v pazuchách listov). Meristémová kultúra je kľúčová pre získanie rastlín bez vírusov, často v kombinácii s termoterapiou.
Z hlavného koreňa rastliny je možné vypestovať dlhoročnú koreňovú kultúru na získanie účinných látok.
Embryokultúry
Izolácia a pestovanie embryí z plodov umožňuje prekonávať problémy s klíčivosťou semien (napr. pri skorých odrodách čerešní a višní) a medzidruhovým či medzirodovým krížením, kde sa embryo nemusí vyvinúť.
Embryokultúry sa využívajú aj na skrátenie doby dormancie semien a na získanie hybridných rastlín z vzdialených krížení (napr. obilnín).
Haploidné rastliny a čisté línie
Haploidné rastliny, ktoré majú chromozómy len od jedného rodiča, je možné získať z embryí, kde dôjde k potlačeniu chromozómov jedného z rodičov, alebo kultiváciou nezrelých rastlinných pohlavných buniek (gamét).
Haploidné rastliny sú cenným materiálom pre produkciu čistých línií (homozygótnych rastlín) v rámci jednej generácie, čo výrazne skracuje šľachtiteľský proces v porovnaní s tradičnými metódami (6-7 rokov).
Somatická embryogenéza
Proces, pri ktorom sa v telových bunkách rastliny in vitro za definovaných podmienok a s pomocou rastových regulátorov vytvárajú embryá (nie splynutím pohlavných buniek). Tieto somatické embryá nesú rastový aj koreňový pól a môžu byť spracované ako umelé semená.
Praktické využitie in vitro kultúr
Mikropropagácia
Techniky pletivových kultúr umožňujú namnožiť cenný rastlinný materiál a získať rastliny identické s rodičovskou rastlinou. Tento proces sa nazýva mikropropagácia.
Získavanie rastlín s novými kvalitami
Prostredníctvom in vitro kultúr možno získať rastliny s novými vlastnosťami, napríklad odolné voči chorobám, suchu či zasoleniu pôdy.
Produkcia bioaktívnych látok
Pletivové kultúry sú výhodné pre produkciu rastlinných bioaktívnych látok (silíc, éterických olejov, farbív). V niektorých prípadoch môže byť produkcia v kultúrach in vitro dokonca vyššia alebo kvalitnejšia ako z rastlín v prírodných podmienkach. Pre tieto ciele sa používajú špeciálne postupy ako kultivácia bunkových kultúr v bioreaktoroch a imobilizované kultúry.
Technika prúžkovej platne na izoláciu čistej kultúry_Kompletný postup (mikrobiológia)
Pletivové kultúry sa stali jedným z hlavných pilierov rastlinných biotechnológií, umožňujúc cielene upravovať rastliny a prinášajúc významné poznatky pre vedu a prax.